孟加拉国的人畜共患猴泡沫病毒反映了传播和合并感染的不同模式

全文 数字和数据 参考文献 引用 指标 许可 重印和许可 PDF Abstract 猿泡沫病毒 (SFV) 在非人类灵长类动物 (NHP) 中无处不在。 与所有逆转录病毒一样，SFV 的逆转录导致重组和突变。 由于已证明感染 SFV 的人比任何其他猿猴传播的病毒都要多，因此 SFV 是研究人类/NHP 界面上病毒的病毒学和流行病学的潜在强大模型。 在亚洲，SFV 很可能通过日常生活中发生的猕猴咬伤和抓伤传播给人类。 我们分析了来自人类和猕猴的 SFV gag 基因的多个前病毒序列，以表征孟加拉国人类/NHP 界面上的逆转录病毒传播。 在这里，我们报告了人类可以同时感染多种 SFV 毒株的证据，一些个体同时感染了本地 SFV 毒株以及与在另一个地理区域的猕猴中发现的 SFV 相似的毒株。 这些数据与先前的结果相结合，表明人类促进的猕猴移动导致引入非居住型 SFV 和猕猴中的逆转录病毒重组有助于孟加拉国人类的 SFV 多样性。 关键词：孟加拉国新兴传染病逆转录病毒重组猴泡沫病毒传播 介绍泡沫病毒 (FV) 是逆转录病毒的一个亚科，广泛分布在脊椎动物宿主中，包括非人类灵长类动物、猫、牛和马。1Meiering CD，Linial ML。泡沫病毒流行病学和感染的历史视角。 临床微生物学 Rev2001；14：165-176。 [Crossref]、[Web of Science ®]、[Google Scholar] FV 是古老的外源病毒，可在宿主之间有效传播但未知会引起疾病。2Switzer WM、Salemi M、Shanmugam Vet al.猿猴的古代共同物种泡沫病毒和灵长类动物。 自然 2005；434：376-380。 [Crossref]、[Web of Science ®]、[Google Scholar] 尽管猿猴泡沫病毒 (SFV) 在非人类灵长类动物 (NHP) 中几乎无处不在，但在智人中并不流行。 先前已在多个国家和不同种间接触环境中检测到人类感染 SFV，包括北美 NHP 实验室和动物园工作人员、“猴庙”工作人员、宠物主人以及生活在南部和东南部自由放养的猕猴周围的人亚洲和中非的丛林肉猎人。3Gessain A、Rua R、Betsem E、Turpin J、Mahieux R.HTLV-3/4 和猿猴泡沫逆转录病毒：发现、流行病学、跨物种传播和分子病毒学。 病毒学 2013；435：187-199。 [Crossref], [Google Scholar] 迄今为止，已记录在 100 人以上的 NHP 到人类传播 SFV，远远超过其他已知 NHP 传播的逆转录病毒：猿猴免疫缺陷病毒的跨物种传播事件数量、猿猴逆转录病毒 D 或猿 T 细胞淋巴细胞病毒。3Gessain A、Rua R、Betsem E、Turpin J、Mahieux R.HTLV-3/4 和猿猴泡沫逆转录病毒：发现、流行病学、跨物种传播和分子病毒学. 病毒学 2013；435：187-199。 [Crossref], [Google Scholar],4Khabbaz RF, Heneine W, George JRet al. 猿猴免疫缺陷病毒对实验室工作人员的感染。 N Engl J Med1994；330：172-177。 [Crossref], [Google Scholar],5Lerche NW, Switzer WM, Yee JLet al. 职业性接触非人类灵长类动物的人感染 D 型猿猴逆转录病毒的证据。 J Virol2001；75：1783-1789。 [Crossref], [Google Scholar],6Switzer WM, Bhullar V, Shanmugam Vet al. 职业性接触非人类灵长类动物的人中频繁感染猿猴泡沫病毒。 J Virol2004；78：2780-2789。 [Crossref]、[Web of Science®]、[Google Scholar]、7Kalish ML、Wolfe ND、Ndongmo CBet ​​al. 暴露于猿猴免疫缺陷病毒的中非猎人。 Emerg Infect Dis2005;11:1928-1930。 [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] 鉴于 SFV 在 NHP 中的高流行率以及人类与 NHP 之间接口的多样性和范围，估计全球感染人数可能达到数十8Engel G、Hungerford LL、Jones-Engel Let al.风险评估：预测猕猴猴泡沫病毒跨物种传播的模型（M. fascicularis) 在印度尼西亚巴厘岛的一座猴庙里传给人类。 Am J Primatol2006；68：934-948。 [Crossref], [Google Scholar],9Switzer WM, Shaohua T, Ahuka-Mundeke Set al. 来自刚果民主共和国女性的多种猴种的新型猿猴泡沫病毒感染。 逆转录病毒学 2012；9:100。 [Crossref], [Google Scholar] 此外，对 SFV 感染人类的​​少数纵向研究表明，SFV 不会从一个人传播给另一个人。 10Boneva RS、Switzer WM、Spira TJet 等。人类持续感染猿猴的临床和病毒学特征泡沫病毒。 AIDS Res Hum Retroviruses2007；23：1330-1337。 [Crossref]、[Web of Science ®]、[Google Scholar] 因此，对影响 SFV 人畜共患病传播的因素进行表征可能为理解某些 NHP 病毒如何以及为何能够导致持续的人类传播提供最佳的当代模型。 - 人类传播。我们小组在过去 6 年中研究了孟加拉国人类与 NHP 之间的界面，重点研究传染性病原体的跨物种传播。11Oberste MS、Feeroz MM、Maher Ket al.表征非人类灵长类动物中的小核糖核酸病毒景观在孟加拉国，2007-2008 年。 J Virol2013；87：558-571。 [Crossref]、[Google Scholar]、12 Oberste MS、Feeroz MM、Maher Ket al.在达卡动物园的非人类灵长类动物中自然获得小核糖核酸病毒感染。 J Virol2013；87：572-580。 [Crossref]、[Google Scholar]、13Karlsson EA、Engel GA、Feeroz MMet al.非人类灵长类动物的流感病毒感染。 Emerg Infect Dis2012；18：1672-1675。 [Crossref], [Web of Science®], [Google Scholar] 孟加拉国是世界上人口最稠密的国家之一，许多城市地区位于 NHP 栖息地内或附近。 几种 NHP 类群原产于孟加拉国，其中恒河猴 (Macaca mulatta) 数量最多且分布最广。 14Hasan K、Aziz MA、Alam SMet al. 孟加拉国恒河猴 (Macaca mulatta) 的分布：群体间种群差异大小和组成。 灵长类动物保护组织 2013；26：115-124。 [Crossref], [Google Scholar] 随着森林栖息地的不断减少，小型、生态灵活的恒河猴在人类改变的栖息地中茁壮成长，尤其是在文化态度鼓励其宽容的地区。15Feeroz MM、Soliven K、Small CTet al.Population dynamics孟加拉国的恒河猴和相关泡沫病毒。 新兴微生物感染 2013；2：e29。 [Taylor & Francis Online]、[Google Scholar] 虽然人类与恒河猴之间的接触主要发生在猕猴自由放养的社区，但也发生在已成为猕猴避难所的宗教圣地和通过饲养猕猴的宠物。 此外，一个游牧民族，也被称为 Bade 或 Qalandar，几个世纪以来一直在该地区旅行，通过与训练有素的猕猴表演表演谋生。 与非洲不同，孟加拉国很少用猴子猎取丛林肉，仅限于与缅甸接壤的吉大港山区的土著人民。16Chowdhury MSH、Halim M、Miah Met al。研究交流：通过从森林中收获动物资源来利用生物多样性孟加拉国吉大港山区的 Mro 部落。 Int J Biodiversity Sci Manage2007；3:56-62。 [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] NHP 到人类的 SFV 传播被认为最常通过叮咬发生。 SFV 在受感染猴子的口腔黏膜中积极复制，在唾液中达到高浓度，在那里可以很容易地检测到基因组和 mRNA。17Murray SM、Picker LJ、Axthelm MK、Linial ML。用猿猴免疫缺陷病毒扩展泡沫病毒复制的组织靶标-诱导免疫抑制。 J Virol2006；80：663-670。 [Crossref], [Google Scholar] 然而，关于宿主或病毒特征如何影响 SFV 传播的知识相对较少。 即使是严重的咬伤也不能可靠地导致感染。9Switzer WM、Shaohua T、Ahuka-Mundeke Set al.来自刚果民主共和国女性的多种猴种的新型猿猴泡沫病毒感染。 逆转录病毒学 2012；9:100。 [Crossref], [Google Scholar] 相反，一些记录在案的感染者不记得曾大量接触 NHP 或 NHP 组织。关于人畜共患 SFV 传播和感染的其他重要问题仍未解决。 例如，虽然在一些 SFV 感染的人类中持续检测了数十年来的前病毒 DNA； 其他人开发出针对 SFV 的抗体，但无法检测到前病毒 DNA。3Gessain A、Rua R、Betsem E、Turpin J、Mahieux R.HTLV-3/4 和猿猴泡沫逆转录病毒：发现、流行病学、跨物种传播和分子病毒学。 病毒学 2013；435：187-199。 [Crossref], [Google Scholar] 是否有些人能清除感染，或者某些病毒株是否更能持久存在还有待发现。 需要进一步的研究来确定，类似于 SIV/HIV，在新宿主中逆转录病毒株之间的重组是大流行病毒进化的先兆事件，是否有证据表明 SFV 在人类宿主中重组。 很少有研究确定唾液中 SFV 的浓度是否会影响人畜共患病的传播，或者人类免疫反应如何促进或预防感染或持续的病毒血症（Soliven 等，XNUMX）。 和 Matsen 等人，未发表）。 虽然在其他地理区域和其他人与猕猴接触的背景下收集的数据提供了对人口统计变量以及猕猴和人类行为如何导致猕猴对人类进行攻击的可能性的见解，但对这些变量如何影响逆转录病毒的了解相对较少。 18Fuentes A, Gamerl S. 印度尼西亚巴厘岛 Padangtegal 猴林的长尾猕猴 (Macaca fascicularis) 与人类游客之间积极互动的年龄/性别不成比例的参与。 Am J Primatol2005；66：197-204。 [Crossref], [Google Scholar] 在这里，我们提供了描述人类暴露于恒河猴和在孟加拉国的几个地点和表演猴子主人感染 SFV 的数据。 大多数其他研究都集中在 pol 基因（整合酶）的一个区域，该区域高度保守，因此可能无法揭示在一个物种的受感染个体中发现的 SFV 变异。 我们从全血中获得了多个克隆，并对部分 SFV gag 基因进行了测序，选择了 pol 以揭示更大的 SFV 遗传变异，并使用序列数据将人类中发现的病毒与与它们相互作用的猕猴中发现的病毒进行比较. 我们表明人类可以同时感染多种 SFV 毒株； 有些人既感染了本土（起源于发现的地方）SFV 毒株，也感染了与在其他地理区域的猕猴中发现的 SFV 相似的毒株。 年龄增加是人畜共患病传播 SFV 的重要危险因素。 女性和印度教也可能与风险增加有关。 这些数据与我们之前的结果相结合 15Feeroz MM、Soliven K、Small CTet al. 孟加拉国恒河猴和相关泡沫病毒的种群动态。 新兴微生物感染 2013；2：e29。 [Taylor & Francis Online]、[Google Scholar] 表明，人为促进的猕猴运动、多次 SFV 感染和逆转录病毒重组都有助于孟加拉国的逆转录病毒多样性。材料和方法研究地点和人群研究人群包括在五个社区采样的 209 名人类受试者站点（Sylhet、Bormi、Dhamrai、Narayanganj 和 Charmaguria），以及 13 位属于游牧团体的表演猴子主人，他们以他们训练有素的猕猴表演表演。 社区站点于 2007 年在猕猴自由活动且居民愿意参与传染性病原体跨物种传播的纵向研究的地方建立。 当我们在往返于我们的社区研究地点的途中遇到表演猴子的主人时，我们会随机抽样。 我们的配套研究中介绍了对孟加拉国猴子 SFV 多样性的分析。15Feeroz MM、Soliven K、Small CTet al.孟加拉国恒河猴和相关泡沫病毒的种群动态。 新兴微生物感染 2013；2：e29。 [Taylor & Francis Online]、[Google Scholar] 该研究的数据也构成了本研究中调查的猕猴 SFV 数据集的一部分。 在这里，我们简要介绍了本研究中包含的现场站点（图 1）。 孟加拉国的人畜共患猴泡沫病毒反映了传播和合并感染的不同模式所有作者格雷戈里·A·恩格尔、克里斯托弗·T·斯莫尔、Khanh Soliven、Mostafa M Feeroz、Xiaoxing Wang、M Kamrul Hasan、Gunwha Oh、SM Rabiul Alam、Karen L Craig、Dana L Jackson、Frederick A Matsen IV、Maxine L Linial 和 Lisa Jones-Engel https://doi.org/10.1038/emi.2013.60 在线发布时间：25 年 2019 月 1 日图 XNUMX 在人畜共患感染的人类受试者中检测到的 SFV 菌株的采样位置和多样性。 在恒河猴自由放养的孟加拉国的五个城市地点对人类受试者进行了采访和采样。 我们最近表明，在这些地点中的每一个，都可以在猕猴中检测到 SFV 的核心菌株。15Feeroz MM、Soliven K、Small CT 等。孟加拉国恒河猴和相关泡沫病毒的种群动态。 新兴微生物感染 2013；2:e29。 [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] 恒河猴 SFV 核心菌株在这张地图上用颜色编码。 对于被发现感染了 SFV 的人类受试者（用“BGH”表示），我们从全血中获得了多个克隆，并对部分 SFV gag 基因进行了测序。 序列数据用于比较在人类中发现的病毒与在该站点的猕猴中发现的病毒。 每个 BGH 标识符旁边的圆圈颜色表示在这些人中检测到的 SFV 毒株。 请注意，其中四名受试者同时感染了多种 SFV 毒株，一些个体同时感染了本地（起源于发现地）SFV 毒株以及与在其他地理区域的猕猴中发现的 SFV 相似的毒株。 nks，无已知来源。显示全尺寸图 1 在人畜共患感染的人类受试者中检测到的 SFV 菌株的采样位置和多样性。 在恒河猴自由放养的孟加拉国的五个城市地点对人类受试者进行了采访和采样。 我们最近表明，在这些地点中的每一个，都可以在猕猴中检测到 SFV 的核心菌株。15Feeroz MM、Soliven K、Small CT 等。孟加拉国恒河猴和相关泡沫病毒的种群动态。 新兴微生物感染 2013；2:e29。 [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] 恒河猴 SFV 核心菌株在这张地图上用颜色编码。 对于被发现感染了 SFV 的人类受试者（用“BGH”表示），我们从全血中获得了多个克隆，并对部分 SFV gag 基因进行了测序。 序列数据用于比较在人类中发现的病毒与在该站点的猕猴中发现的病毒。 每个 BGH 标识符旁边的圆圈颜色表示在这些人中检测到的 SFV 毒株。 请注意，其中四名受试者同时感染了多种 SFV 毒株，一些个体同时感染了本地（起源于发现地）SFV 毒株以及与在其他地理区域的猕猴中发现的 SFV 相似的毒株。 nks，来源不明。锡尔赫特位于该国东北部，距印度阿萨姆省35公里以内，是孟加拉国第三大城市。 在市中心的 Shah Jalal 神社发现了大约 125 只猕猴。 锡尔赫特的猕猴遍布神社遗址并进入紧邻的社区。 Shah Jalal 的猕猴由神社工作人员定期提供，并经常从神社游客那里获得食物。 居住在神社附近的 50 名人类受试者参与了这项研究。 博尔米在达卡以北约 200 公里的博尔米镇，XNUMX 多只恒河猴分布在整个村庄，在印度教和穆斯林地区之间自由活动，经常进入家庭寻找的食物。 虽然一些博尔米居民偶尔会为猕猴提供食物，但没有有组织的供应。 共有来自博尔米的 105 名人类受试者参与了这项研究。达姆莱镇位于博尔米西南 40 公里处。 大约 75 至 100 只猕猴自由活动穿过 Dhamrai。 猕猴喜欢有大树荫和果树的地区，这在印度教社区更常见。 与博尔米一样，没有有组织的猕猴供应。 该数据集中包括来自 Dhamrai 的 20 名受试者。NarayanganjNarayanganj 是一个人口稠密的港口城市，位于达卡以南约 XNUMX 公里处。 随着城市发展取代绿色空间，该地区的恒河猴种群继续下降。 这座城市中估计有 60 只猕猴没有供应，也没有很好地适应人类。 来自 Narayanganj 的 150 名人类受试者参与了这项研究。CharmaguriaCharmaguria 位于达卡以南/西南 XNUMX 公里处，沿帕德玛河。 该地区的 200 多只猕猴由当地组织在中心位置提供，这个小镇丰富的绿地提供了自然走廊，动物可以沿着这些走廊广泛分布。 来自 Charmaguria 的 23055 名人类受试者参与了这项研究。华盛顿大学人类受试者审查委员会 (XNUMX) 和类似审查委员会批准了招募、知情同意和抽样方案，包括对 SFV 阳性个体的随访。孟加拉国贾汉吉尔纳加尔大学。 来自人类受试者的生物和人口统计数据使用以“BanGladesh Human”（BGH）开头的独特匿名标识符进行编码。 在每个社区站点，孟加拉国团队成员开始与社区领导人联系，并在猕猴活动范围内确定了一个中心位置来收集数据。 孟加拉国团队成员随后与社区居民合作，步行散开，要求自称被猕猴咬伤或受伤的人参与。 受试者的纳入标准包括年龄大于 18 岁、自我报告接触 NHP 和/或长期（>20 年）居住在村庄。 从所有受试者获得书面知情同意书。 人口统计数据和描述 NHP 暴露的数据是通过团队成员用当地语言孟加拉语管理的问卷获得的。 从每个受试者的肘前静脉中收集 12 毫升全血，放入含有乙二胺四乙酸的管中，在冰上储存不超过 XNUMX 小时，然后离心。 全血和血浆等分试样在分析前储存在 -80 °C。 Whatman Sterile Omni Swabs (Whatman, Piscataway, NJ, USA) 用于获取口腔黏膜样本。 将拭子立即放入 500 µL Qiagen Buffer RLT（Qiagen，Valencia，CA，USA）中，在冰上冷却不超过 12 小时，然后在 -80°C 下冷冻直至分析。 这些方法与我们用于获取和储存源自猕猴的生物样本的方法基本相同。15Feeroz MM、Soliven K、Small CTet al.孟加拉国恒河猴和相关泡沫病毒的种群动态。 新兴微生物感染 2013；2:e29。 [Taylor & Francis Online], [Google Scholar]重复采样已确认的 SFV 阳性人类如果人类受试者通过聚合酶链反应 (PCR) 被确认为 SFV 阳性，研究团队试图在初次采样后大约 1 年联系并重新采样该受试者. SFV 阳性受试者后续采样的生物样本收集协议与初始采样期间使用的相同。 此外，SFV 阳性受试者接受了简短的体检并收集了深入的病史。恒河猴采样我们为该项目准备的配套手稿15Feeroz MM、Soliven K、Small CTet al.孟加拉国恒河猴和相关泡沫病毒的种群动态。 新兴微生物感染 2013；2:e29。 [Taylor & Francis Online]、[Google Scholar] 提供所有动物采样和实验室协议。 本研究包括来自总共 184 只恒河猴的 SFV 堵嘴序列（图 2）。 我们还在这个数据集中包含了从四只恒河猴中获得的序列，两个来自 Dhamrai，两个来自 Bormi，我们能够在它们初始采样两年后重新采样。 孟加拉国的人畜共患猴泡沫病毒反映了传播和共同感染的不同模式所有作者格雷戈里·A·恩格尔、克里斯托弗·T·斯莫尔、Khanh Soliven、Mostafa M Feeroz、Xiaoxing Wang、M Kamrul Hasan、Gunwha Oh、SM Rabiul Alam、Karen L Craig、Dana L Jackson、Frederick A Matsen IV、Maxine L Linial 和 Lisa Jones-Engel https://doi.org/10.1038/emi.2013.60 在线发布时间：25 年 2019 月 2 日图 XNUMX 来自采样种群的猴子的血型分类。 对于每只猴子，对应于猴子采样种群的颜色条显示在 (A) 中，对应于在该猴子的血液样本中观察到的菌株的彩色图块显示在 (B) 中。 根据与亲本菌株建立的重组关系标记非核心菌株。 阳性匹配定义为 cBrother 分析中 90 个或更多连续碱基对的可能性至少为 200%。 基因组区域在至少 200 nt 内没有匹配超过该阈值的亲本菌株被标记为 nks（未知来源）。 这是本研究配套论文 15Feeroz MM、Soliven K、Small CT 等人的简化版本。孟加拉国恒河猴和相关泡沫病毒的种群动态。 新兴微生物感染 2013；2:e29。 [Taylor & Francis Online]、[Google Scholar] 但更新了品系分类。显示全尺寸图 2 来自采样种群的猴子的血液品系分类。 对于每只猴子，对应于猴子采样种群的颜色条显示在 (A) 中，对应于在该猴子的血液样本中观察到的菌株的彩色图块显示在 (B) 中。 根据与亲本菌株建立的重组关系标记非核心菌株。 阳性匹配定义为 cBrother 分析中 90 个或更多连续碱基对的可能性至少为 200%。 基因组区域在至少 200 nt 内没有匹配超过该阈值的亲本菌株被标记为 nks（未知来源）。 这是本研究配套论文 15Feeroz MM、Soliven K、Small CT 等人的简化版本。孟加拉国恒河猴和相关泡沫病毒的种群动态。 新兴微生物感染 2013；2：e29。 [Taylor & Francis Online]、[Google Scholar] 但更新了菌株分类。SFV 检测Western blot 恒河猴成纤维细胞 Telo-RF 细胞系 19Kirchoff V, Wong S, St JS, Pari GS.Generation of an life-expanded Rheus monkey 成纤维细胞系恒河猴鼻病毒 (RRV) 的生长。 Arch Virol2002；147：321-333。 [Crossref], [Google Scholar] 感染了SFV M。 混血儿或M。 束状，或未感染。 48 小时后，细胞在 1× 十二烷基硫酸钠样品缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 6.8）、10% 甘油、2% 十二烷基硫酸钠、5% 2-巯基乙醇、0.01% 溴酚蓝）中裂解，样品电通过 10% 聚丙烯酰胺凝胶滋养。 将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore Billerica，MA，USA）后，将膜在磷酸盐缓冲盐水 + 0.05% Tween-20（含 2% 脱脂奶粉）中封闭，用水冲洗并晾干。 制成条带，每个条带包含三个泳道（分子量标记、未感染的 Telo-RF 和感染的 Telo-RF 细胞裂解物），并以 1∶20 稀释加入一抗（人血浆），并在 4°C 下孵育过夜。 在加入二级山羊抗人辣根过氧化物酶（Thermo Scientific and GE Healthcare Rochester, NY, USA）0.05∶20 稀释液室温下，用磷酸盐缓冲盐水 + 1% Tween-5000 洗涤 1 次。 . 在用水冲洗并应用 3,3',5,5'-四甲基联苯胺稳定的辣根过氧化物酶底物（Promega Madision，WI，USA）之前，将试纸再洗涤 XNUMX 次以显示条带。 来自 BGH4 的血浆，一种已知的 SFV 阳性人类 20Jones-Engel L、May CC、Engel GA 等。亚洲猿猴泡沫病毒人畜共患病传播的不同背景。 Emerg Infect Dis2008；14:1200-1208。 [Crossref], [Google Scholar] 用作阳性对照。从全血中分离 DNA 根据制造商的方案，使用 QIAamp DNA 血液迷你试剂盒 (Qiagen) 从人类全血中提取总基因组 DNA。 我们从 200 µL 全血中提取 DNA。 纯化的 DNA 在 200 µL 缓冲液 AE 中洗脱。从基因组 DNA 中对 gag 和 pol 片段进行 PCR 扩增 总共 15 µL 的分离 DNA 用于通过两轮 PCR 对 gag 或 pol 片段进行 PCR 扩增。 第一轮 PCR 是使用 gag 和 pol 引物的多重反应（引物序列：G1 (+)(nt 114–134，取自 SFV1 GeneBank 序列 NC_001364 NC_001736）5'-AGG ATG GTG GGG ACC AGC TA-3'；G2 (-) (nt 1451–1433) 5′-CAG GAA GAG GTA CTC GGG G-3′；P1 (+) (nt 5179–5200) 5′-GCC ACC CAA GGA AGT TAT GTG G-3′；P2 ( -) (nt 5768–5749) 5'-GCT GCC CCT TGG TCA GAG TG)-3'。 反应在 95 °C 下变性 3 min，然后是 95 °C 30 s、38 °C 1 min、72 °C 1 min 的两个循环，然后是 25 °C 95 s 的 30 个循环, 52 °C 1 分钟和 72 °C 1 分钟。 水用作阴性对照。 2 µL PCR 产物用作第二轮 PCR 的模板。 gag 或 pol 引物 (G3 (+) (nt 190–212) 5′-CAA CCT AGA TGG AGA GCT GAA GG-3′；G4 (-) (nt 1425–1406) 5′-GGG GAC AAA CTA CGG CTG GG-3′；P5 (+) (nt 5339–5361) 5′-TAA TCC TCC AGG GTA TCC AAA A-3′；P6 (-) (nt 5728–5707) 5′-ATA CCA TCG ACT ACT ACA AGG A-3') 用于扩增单个片段。 反应在 95°C 下变性 3 分钟，然后是 35°C 95 秒、30°C 52 分钟和 1°C 72 分钟的 1 个循环。 gag 和 pol 的 PCR 产物的预期大小分别为 1235 bps 和 390 bps。 gag 片段的克隆和测序 FV PCR 产物使用 QIAquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen) 根据制造商的方案进行凝胶纯化。 将纯化的片段连接到 TOPO-TA 克隆载体（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）并转化大肠杆菌 TOP10 感受态细胞（Invitrogen）。 为每个 gag 样品选择多个单菌落，并纯化和测序质粒 DNA。 使用 M13 正向和反向引物以及华盛顿大学基因组学设施或 GeneWiz Inc. 的 gag 内部正向和反向引物进行测序。 （西雅图，华盛顿州，美国）。 病毒株用小写字母表示，以区别于采集人类或猕猴的地理地点（例如，Dhamrai 是检测到 dhamrai 核心菌株的研究地点。）从口腔拭子中分离 RNA RLT 缓冲液中的冷冻口腔拭子样本(Qiagen) 在 RNA 提取之前立即用 37 U 的 RNaseOUT 核糖核酸酶抑制剂 (Invitrogen) 和 15 U 的 RNase-free DNase I (Promega) 在 40°C 下解冻 1 分钟。 根据标准方案使用 RNeasy Mini Kit (Qiagen) 提取总 RNA。 RNA 再次用 40 U 的 RNaseOUT 和 1 U 的 RNase-free DNase I 在 37°C 下处理 1 小时。 然后将样品在 65°C 下孵育 15 分钟以灭活酶。 RNA 储存在 -20 °C 以备后续使用。 口腔拭子 RNART-PCR 的逆转录 PCR (RT-PCR) 用于从口腔拭子 RNA 克隆部分 gag 序列 (1235 bp)。 第一链 cDNA 是使用 Thermoscript RT-PCR 系统 (Invitrogen) 根据制造商的方案使用 Oligo(dT)18 引物合成的。 RT 反应在 85°C 下灭活 5 分钟。 所得的 cDNA 用作如上所述的两轮 PCR 的模板，用于全血 FV gag 扩增。分析聚类方法和超突变分析 本研究中检查的序列显示了 APOBEC3 介导的超突变的证据。 Matsen 等人对这项活动进行了彻底的分析。 （未发布）。 该分析通过去除疑似超突变的列产生推定的超突变负序列比对。 这些比对用于本研究中的其余分析，以避免将超突变和真正的系统发育信号混为一谈。用轮廓而不是距离矩阵计算大的最小进化树。 Mol Biol Evol2009；26：1641-1650。 [Crossref]、[Web of Science ®]、[Google Scholar]、22Price MN、Dehal PS、Arkin AP.FastTree 2 — 用于大型对齐的近似最大似然树。 PLoS ONE2010;5:e9490。 [Crossref]、[Web of Science®]、[Google Scholar] 这棵树是使用始祖鸟 (https://sites.google.com/site/cmzmasek/home/software/archaeopteryx) 可视化的。 来自相同的比对，SplitsTree 4.12.823Huson DH，Bryant D.系统发育网络在进化研究中的应用。 Mol Biol Evol2006；23:254-267。 [Crossref]、[Web of Science®]、[Google Scholar] 用于生成分裂网络。应变分析通过将超突变负比对传递给迭代重心聚类算法来识别应变。 结果发现，UCLUST v1.124Edgar RC.Search 和聚类的单个应用程序比 BLAST 快几个数量级。 生物信息学 2010；26：2460-2461。 [Crossref]、[Web of Science®]、[Google Scholar] 由于算法的贪婪特性而产生了较差的聚类结果。 由 UCLUST 作者在 http://drive5.com/usearch/manual/recenter.html 上建议的迭代重定位算法已经实现，该算法很好地处理了这个问题。 对于每一轮聚类，将前一轮的共有序列添加到无间隙比对的顶部，按照簇大小从最大到最小的顺序。 对于这次迭代，使用 cluster_smallmem 进行聚类，产生新的一致序列和聚类。 这个过程重复两次。 集群分配由一个脚本进一步微调，该脚本发现每个集群的真实质心，如由与集群中每个其他序列具有最小平均归一化汉明距离的序列所定义。 然后检查脚本以确保每个序列都与它最接近的质心聚类（同样，由归一化汉明距离定义），根据需要进行重新分配。使用 97.77% 的阈值应用该迭代算法。 该阈值虽然略高于我们的配套研究中使用的阈值，15Feeroz MM、Soliven K、Small CTet al.孟加拉国恒河猴和相关泡沫病毒的种群动态。 新兴微生物感染 2013；2:e29。 [Taylor & Francis Online]、[Google Scholar] 更好地反映了由于去除了疑似超突变的列而导致的序列多样性略低。 如上所述，病毒株用小写字母表示，以将它们与人类或猕猴采样的地理地点区分开来（例如，Dhamrai 是主要发现 dhamrai 核心株的研究地点。）统计方法人口统计学变量的统计分析是使用 JMP（SAS Institute，Cary，NC，USA）统计软件包执行； 列联表的分析是使用 R fisher.test 函数进行的。25 R 核心团队。 R：一种用于统计计算的语言和环境。 维也纳：R 统计计算基金会，2012 年。[Google Scholar]结果人口统计数据包括 NHP 暴露在 5-2007 年的 2011 年期间，从 222 人中收集了生物样本。

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